Auch nachdem die Borgias in Rom besiegt wurden, hat Ezio noch einiges zu tun. Im vierten DLC "Da Vincis Verschwinden" zu "Assassin’s Creed Brotherhood" wird Ezios alter Freund Leonardo von Hermetikern, einem okkulten Untergrundkult, entführt. Um ihn zu retten, muss Ezio die Geheimnisse des Ordens lüften. Was es dabei mit den geheimnisvollen Gemälden auf sich hat, bleibt abzuwarten. Auch im Mehrspieler-Modus erwartet die Spieler eine neue Karte und ein neuer Modus. Alhambra, eine andalusische Stadt auf dem Berg Assabica, stellt dabei den perfekten Spielplatz für Jäger und Gejagte dar. Der DLC "Da Vincis Verschwinden" ist ab sofort für Xbox 360 für 800 Microsoft Punkte erhältlich. Für PlayStation 3 erscheint der DLC am 09. März 2011 über PlayStation Network zu einem Preis von 9,99€.
